【多肽定制】多肽的結構分析方法

(一)多肽的結(jié)構(gòu)分析方法——質譜

經典的多肽測序方法包括N末端序列測定的化學方法，如Edman法、C末端酶解方法及C末端化學降解法等，這些方法都存在一定缺陷。例如作爲多肽和蛋白質序列測定标準方法的N末端氨基酸苯異硫氰酸酯(phenylisothiocyanate，PITC)分析法(即Edman法，又稱PTH法)，測序速度較慢(每天50個氨基酸殘基)；樣品用量較大(nmol級或幾十pmol級)；對樣品純度要求很高；對修飾氨基酸殘基往往會産生錯誤識别，而對N末端保護的肽鏈則無法測序。C末端化學降解測序法則由於(yú)無法找到PITC這樣理想的化學探針，仍面臨著(zhe)很大的困難。在這種背景下，質譜(mass spectrometry，MS)由於(yú)具有較高的靈敏度、準確性、易操作性而備受關MS用於(yú)多肽序列測定時，靈敏度及準確性随分子量增大而明顯降低，所以採用MS進行多肽序列分析比蛋白質簡單，許多研究均是以多肽作爲分析對象。近年來随著(zhe)電噴霧電離質譜(electrospray ionisation，ES)及基質輔助激光解吸質譜(matrix assisted laser desorption/Ionization，MALD)等質譜軟電離技術的發展與完善，使極性大分子多肽的分析成爲可能，檢測限可達fmol級，可測定的分子量範圍則高達100kDa。目前MALD已成爲測定生物大分子尤其是蛋白質、多肽分子量和一級結構的有效工具。

(二)多肽的結(jié)構(gòu)分析方法——核磁共振

由於(yú)信号的純數字化、重疊範圍過寬(由於(yú)相對分子質量太大)和信号弱等，核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)圖譜在多肽的分析中應用較少，随著(zhe)二維、三維以及維NMR的應用，分子生物學、計算機處理技術的發展，NMR才逐漸成爲多肽分析的主要方法之一。NMR可用於(yú)確定氨基酸序列及定量混合物中的各組分含量等，但應用於(yú)多分析中仍有許多問題需要解決，例如，如何使分子量大的多肽有特定的形狀面便於(yú)定量與定性分析，如何縮短數據處理的時間等，這些問題均有不少學者在進行研究，NMR在分析含少於(yú)30個氨基酸的多肽時比較有效

最近的超高場(chǎng)超導磁鐵的建造已将NMR研究的分子質量範圍擴展到100kD以上如此大的蛋白質分子，其NMR譜常遇到譜帶增寬的問題，Wuthrich等研究的橫向池豫優化光譜法(transversal relaxation optimized spectroscop，TRDSY爲此提供瞭(le)解決方法

(三)多肽的結構(gòu)分析方法——紅(hóng)外光譜

動圖封面

紅外光譜是鑒定有機化合物結構的重要方法，具有樣品用量小和不需要高純(chún)晶體等特點。用紅外光譜法研究多肽等的結構、構象，能反映與正常生理條件(水溶液、溫度、酸堿性等）相似情況下的生物大分子的結構變(biàn)化信息，這是用其它方法難以做到的。

用傅裏葉變(biàn)換紅外光譜方法研究蛋白質和多肽二級結構，主要是對紅外光譜中的酰胺I譜帶(氘代後，稱酰胺I譜帶)進行分析，酰胺I譜帶爲α螺旋，β折疊、無規則卷曲和轉角等不同結構振動峰的加合帶，彼此重疊，在1620~42500px-1範圍内通常爲一個不易分辨的寬譜帶。目前常應用去卷積微分等數學方法，對加合帶中處於(yú)不同波數的各個吸收峰進行分辨，最後經譜帶拟合，獲得各個吸收峰的定量信息。

紅外光譜可用於(yú)監測酰胺質子的交換速率，暴露於(yú)表面的質子比處於(yú)中心的質子H/D交換要快得多。内部伸縮區或參(cān)與二級結構形成的酰胺質子交換速率爲中等。它可以提供多肽或蛋白質的所有氨基酸殘基的信息。

(四)多肽的結(jié)構(gòu)分析方法——紫外光譜

在研究生物大分子的溶液構象時，紫外可見吸收光譜是十分重要的方法。它對測(cè)定樣品沒有特殊要求，隻需處於(yú)溶液狀态即可，因此紫外光譜在探索生物大分子結構與功能的關系方面可獲得有意義的信息。蛋白質在紫外光範圍内(250~300mm)的光吸收主要是由於(yú)芳香族氨基酸Trp及Tyr，其次是Phe和His的電子激發引起的。

(五)多肽的結(jié)構(gòu)分析方法——圓二色譜

多肽多爲手性分子，實驗室主要採用圓二色譜(circular Dichroism spectra，CD)研究分子的立體結構、反應動力學及在溶液中的構象變化等。CD譜具有UV分析相同的精密度但比UV的靈敏度高，而且在UV譜中的重疊的峰在CD譜中也有可能分開。CD的測定通常是分子橢圓度[θ]的測定，它表示該物質由於(yú)分子的光學不對稱性而對左、右圓偏振光有不同程度的吸收。根據Cotton效應，[θ值隻在吸收峰有較大的值，並(bìng)且與吸收峰波長位置相對應，而多肽的紫外吸收光譜主要有兩個吸收峰，在280m處的吸收峰由芳香族側鏈引起(主要是Tyr、Tp、Phe)，但在波長約低於(yú)230mm時，不但有其他氨基酸側鏈的電子躍遷，還有肽鏈骨架本身電子位移的躍遷所引起的吸收，因而通過對這一區域的CD研究可以分析多肽主鏈的構象。

(六)多肽的結(jié)構(gòu)分析方法——X射線晶體學

X射線晶體學方法是迄今爲止研究蛋白質結構有效的方法，所能達到的精度是任何其他方法所不能比拟的。其缺點是蛋白質/多肽的晶體難以培養，晶體結構測定的周期較長。X射線衍射技術能夠精確(què)測定原子在晶體中的空間位置；中子衍射和電子衍射技術則用於(yú)彌補X射線衍射技術的不足。生物大分子單晶體的中子衍射技術用於(yú)測定生物大分子中氫原子的位置；纖維狀生物大分子的X射線衍射技術用於(yú)測定這類大分子的一些周期性結構，如螺旋結構等；電子顯微鏡技術能夠測定生物大分子的大小、形狀及亞基排列的二維圖像；它與光學衍射和濾波技術結合而成的三維重構技術能夠直接顯示生物大分子低分辨率的三維結構。

除上述方法之外，場解析質譜、生物鑒定法、放射性同位素标記法及兔疫學方法等都已應用於(yú)多肽類物質的結構鑒定、分析檢測(cè)之中。