HPLC小知識
發布日期：2023-02-13 作者：吉泰肽業 點擊：
1、用HPLC進行分析時保留時間有時發(fā)生漂移，有時發(fā)生快速變(biàn)化，原因何在?如何解決?
①溫度控制不好，解決(jué)方法是採(cǎi)用恒溫裝置，保持柱溫恒定;
②流動相發生變(biàn)化，解決辦(bàn)法是防止流動相發生蒸發、反應等;③柱子未平衡好，需對(duì)柱子進行更長(zhǎng)時間的平衡;①流速發生變(biàn)化，解決辦(bàn)法是重新設定流速，使之保持穩定;②泵中有氣泡，可通過(guò)排氣等操作将氣泡趕(gǎn)出;③流動相不合适，解決辦(bàn)法爲改換流動相或使流動相在控制室内進行适當(dāng)混合;
2、液相色譜(pǔ)中峰出現拖尾或出現雙峰的原因是什麽(me)?①篩闆堵塞或柱失效，解決辦(bàn)法是反向沖(chōng)洗柱子，替換篩闆或更換柱子;②存在幹擾峰，解決辦(bàn)法爲使用較長(zhǎng)的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子;
①樣品量不足，解決(jué)辦(bàn)法爲增加樣品量;②樣品未從(cóng)柱子中流出。可根據樣品的化學性質改變(biàn)流動相或柱子;③樣品與檢測(cè)器不匹配。根據樣品化學性質調整波長(zhǎng)或改換檢測(cè)器;④檢測(cè)器衰減太多。調(diào)整衰減即可;⑤檢測器時間常數太大，解決辦(bàn)法爲降低時間參(cān)數;⑥檢測(cè)器池窗污染。解決辦(bàn)法爲清洗池窗;⑦檢測(cè)池中有氣泡。解決辦(bàn)法爲排氣;⑧記錄儀測(cè)壓範圍不當(dāng)。調整電壓範圍即可;⑨流動(dòng)相流量不合适。調(diào)整流速即可;⑩檢測(cè)器與記錄儀超出校正曲線。解決辦(bàn)法爲檢查記錄儀與檢測(cè)器，重作校正曲線。
4、做HPLC分析時，柱壓不穩定，原因何在?如何解決?①泵内有空氣，解決的辦(bàn)法是清除泵内空氣，對溶劑進行脫氣處(chù)理;②比例閥(fá)失效，更換(huàn)比例閥(fá)即可;③泵密封墊(diàn)損壞(huài)，更換密封墊(diàn)即可;④溶劑中的氣泡，解決的辦(bàn)法是對溶劑脫氣，必要時改變(biàn)脫氣方法;⑤系統檢(jiǎn)漏，找出漏點(diǎn)，密封即可;⑥梯度洗脫，這時(shí)壓力波動(dòng)是正常的。
5、我最近更換瞭另一種牌号的ODS柱，雖然分離情況仍可以，但保留時間不能重現，爲什麽?這是因爲被分析物可能具有形成氫鍵的能力，盡管過去幾年來，填料的制造技術有瞭(le)極大的提高，但不同的廠商的ods填料表面矽醇基的濃度不同。正是這些矽醇基可能與樣品發生相互作用。因此，同一被分析物中的各組分在不同牌号的ods柱上的相對保留時間就可能不同。在流動相中加入少量競争物，如，三乙基胺(tea)，将會使矽醇基的成鍵能力飽(bǎo)和，從而能保證不同牌号柱子上的相對保留時間具有較好的重現性。如分離情況可以，系統穩定，達到系統适用性要求，就不必保留時間的重現。
6、我購買的HPLC柱驗收測試時柱壓過高，請問爲什麽?柱壓過(guò)高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常並(bìng)不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因：①拆去保護(hù)預柱，看柱壓是否還(hái)高，否則是保護(hù)柱的問題，若柱壓仍高，再檢查;②把色譜柱從(cóng)儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢(jiǎn)查;③将柱子的進出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動相沖洗柱子，(此時，不要連接檢測(cè)器，以防固體顆粒進入流動池)。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查;隻用於(yú)使用過的柱子。④更換柱子入口篩闆，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質，正是這些雜質将篩闆堵塞引起壓力上升。若柱壓還(hái)高，請與廠(chǎng)商聯系。
HPLC分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合适，色譜峰在出峰時間較短的條件下(不包括梯度)，峰型應對稱而尖銳。但是，在對樣品瞭(le)解程度不夠，方法不妥，樣品處理方法及進樣方式不合理下，會出現各種意想不到的問題，而對色譜峰難以作出合理的解釋，尤其對於(yú)新手更是如此。色譜雙峰指的是明是一種物質，但在色譜圖中出現雙峰，而表明含二種物質。這種情況分爲四種原因。
如果你分析樣品時發現每個色譜峰都雙峰出現(出峰越快，雙峰的可能性會減少)，尤其採(cǎi)用單一純物質時，可以肯定色譜柱出問題-柱頭受損或柱頭固定相變髒或流失。如果進樣量少，原來色譜柱正常，色譜峰的形狀多爲一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應是柱頭受堵，将色譜柱反過來接，用流動相沖洗或酸洗或其它溶劑，将堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來，一般情況下就行瞭(le)。當然不反沖，正沖有時也會正常的。如果峰拖尾，雙峰強弱相差不大，柱頭固定相變髒或流失可能性更大，這是可以将進樣那頭擰開，将微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術，同時不能老幹那種事，否則用不瞭(le)幾次，色譜柱就會應柱效很低而報廢。
許多HPLC分析者對此可能不以爲然，一般的HPLC的書籍和文獻都不會提到這方面的内容，而這確是雙峰産生的一個很重要的原因。目前，HPLC分析多爲反相色譜，流動相多爲甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動相溶解，但是很多情況是不一緻的。當用溶劑極性強度大的試劑，如，純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水爲主，樣品進樣量大，如，定量管爲20μL，此條件下完全可以肯定，單一的純物質出雙峰，第二峰比第一峰小(每次都不太一樣)，且拖尾，保留時間會提前(相對進樣量少而言)，将進樣量減少一半以上，峰型将變爲正常。這是樣品的溶劑與流動相極性相差太大，而流動相來不及将其稀釋達到平衡造成的。上面提到進樣量造成雙峰的一個原因，另一個原因是，進樣量不一定大，但絕對量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾(如果出峰很快，也可能是色譜柱問題)。将樣品稀釋再進樣就可以瞭(le)，這是由於(yú)進樣量過大，色譜柱過載造成的。
有些樣品由於(yú)其化學結構的特點，存在互變(biàn)異構現象，而這種互變(biàn)異構體無法分開，而是以一個動态平衡存在。在色譜分析時，在一個特定的條件下，一種物質将出現雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變(biàn)化，尤其pH，雙峰現象将消失，如，紅黴素等。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC-MS下，用質譜檢測器，其質譜的總離子流圖上較明顯。
記錄的參(cān)數一般都内定的，不必修改，但GC和HPLC的參(cān)數是不完全一緻的，例如，c-r3a數據記錄儀上的一般記錄時間間隔GC爲2MS，HPLC爲5MS，如果記錄間隔時間縮短，一個峰将變(biàn)爲二個峰或更多。
不少做色譜分離試驗的人遇到過這樣的情形：不慎未及時補充流動相，泵将溶劑瓶中的流動相吸幹瞭(le)，HPLC系統由此而停止工作瞭(le)。如此情況是否會損壞色譜柱?泵是否已将色譜柱中所有流動相都排幹瞭(le)?色譜柱還能使用嗎?事實上，如果泵将溶劑瓶中的流動相吸幹，並(bìng)不會造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿瞭(le)空氣，泵也不會将空氣排入色譜柱。因爲泵隻能輸送液體，而不能輸送空氣。
相比之下，另一個更可能發生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變幹。同樣，整個色譜柱幹涸的情況不太容易發生，多半可能隻是色譜柱兩端的幾個毫米變幹瞭(le)，因揮發掉所有溶劑是色譜柱變幹需要相當長的時間。即使色譜柱真的變幹瞭(le)，也不一定就不可救藥瞭(le)。可以嘗試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑(如經氦氣脫氣的甲醇)沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助於浸潤填料表面;已脫氣的溶劑應該能夠溶解並(bìng)去除滞留在填料中的氣體。色譜柱大約需要(以1mL/min的流速)沖一個小時或更多的時間被徹底浸潤，恢複到正常狀态。
9、使用peek(poly etheretherketone)管路和接頭需要注意什麽(me)問題(tí)?如果經常需要改變(biàn)流路或更換不同品牌的色譜柱，使用peek材料制成的管路和接頭會非常方便。peek管路容易連接;peek接頭不僅無需工具，手擰即可固定，而且容易調節錐箍之外的管路長(zhǎng)度，方便與不同品牌或規格的色譜柱相連接。
使用此類材料的管路需要注意的是：peek對(duì)鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好。雖然未觀察到上述溶劑溶解peek材料的明顯迹象，但，peek遇到上述溶劑會變(biàn)脆。另一個西藥考慮的因素是壓力限。不鏽鋼管可耐受6000psi的壓力，但peek管隻能耐受近4000psi(但多數hplc應用系統壓力不會超過3000psi)。
使用peek接頭時則無需擔心接頭耐溶劑性能，因爲接頭幾乎或很少與溶劑直接接觸。但手擰固定的peek接頭壓力限低於(yú)不鏽鋼管，因而壓力太高時，可能會使接頭在管路上滑動而産(chǎn)生死體積或漏液。
許多色譜工作者在操作液相色譜時，色譜柱是在室溫環境下工作的。如果實驗室的溫度能保持不變(biàn)的話，不會有什麽大問題。但大多數的工作環境溫度是不斷(duàn)變(biàn)化的，因此若想将在某實驗室開發的一種液相色譜方法應用到其他實驗室的話，溫度的差别就會引起較複雜的問題。溫度的影響在所有的色譜分析方式中都是存在的，本文就來讨論液相色譜方法中的梯度洗脫方式受溫度影響的問題。
大多數色譜工作者知道等度洗脫時溫度會影響保留時間。圖1顯示瞭(le)三個不同溫度下的分離結果。我們發現當溫度升高時所有的色譜峰都前移瞭(le)，等度洗脫時一般溫度每升高一攝氏度保留時間會縮短1-3%，在圖1中，保留時間變(biàn)化率約爲2%/℃。
擁有溫控系統的實驗室一般都有全天候溫控設置，但這種設置可能引起室溫顯著變(biàn)化，這對整夜運行的色譜系統就會有一些影響，例如，我們實驗室的夜間溫度就設爲4～7℃。在不同的季節，實驗室的夜間溫度可能比正常工作日的溫度高或低，這種溫度的變(biàn)化就會使色譜峰離開“保留時間窗”，造成連續進樣中産(chǎn)生一系列的無效數據。
還有一個可能的溫度影響因素就是色譜儀器在實驗室的位置。當色譜柱正對著(zhe)空調的送風口時，雖然整個實驗室的溫度非常穩定，但色譜系統的溫度就會不斷的變(biàn)化。這就是我們要使用柱溫箱的原因之一。
溫度變化對梯度洗脫和等度洗脫的影響趨勢是一樣的。圖2是苯胺和苯酸在三個溫度條件下的色譜圖。圖1中，20℃的溫度變化引起保留因子的變化大約爲兩倍，然而在圖2中，40℃的變化使保留改變瞭(le)約20%。平均來說，圖2中的色譜保留變化約爲0.2%/℃。由此可見，溫度變化對梯度洗脫的影響要小於(yú)對等度洗脫的影響(假定本例具有普遍代表意義)。即便如此，若梯度洗脫時不控制溫度的話，保留值一般都會有較大的變化。
我們發現柱溫在液相色譜梯度洗脫過程中扮演瞭(le)一個重要的角色，首先，提高柱溫可以縮短保留時間，其次，我們看到柱溫還可以影響選擇性，最後，溫度的不平衡會導緻峰扭曲變(biàn)形。這些提醒我們，如果想得到穩定可靠的分離結果，色譜柱的溫度變(biàn)化是不可忽視的。
①柱溫波動。(即使是很小的溫度變(biàn)化都會引起基線的波動。通常影響示差檢測(cè)器、電導檢測(cè)器、較低靈敏度的紫外檢測(cè)器或其它光電類檢測(cè)器。)
②流動相不均勻。(流動相條件變(biàn)化引起的基線漂移大於(yú)溫度導緻的漂移。)
④檢測(cè)器出口阻塞。(高壓造成流通池窗口破裂，産(chǎn)生噪音基線);
⑤流動相配比不當(dāng)或流速變(biàn)化;
⑥柱平衡慢，特别是流動(dòng)相發生變(biàn)化時;
⑦流動(dòng)相污染、變(biàn)質或由低品質溶劑配成;
⑧樣品中有強保留的物質(高k’值)以饅頭峰樣被洗脫出，從(cóng)而表現出一個(gè)逐步升高的基線。
⑨使用循環溶劑，不提倡。未調(diào)整檢測(cè)器。
⑩檢測(cè)器沒有設定在最大吸收波長(zhǎng)處。
①控制好柱子和流動(dòng)相的溫度，在檢測(cè)器之前使用熱交換器;
②使用HPLC級的溶劑，高純(chún)度的鹽和添加劑。流動(dòng)相在使用前進行脫氣，使用中使用在線脫氣或氦氣脫氣。
③用甲醇或其他強極(jí)性溶劑沖(chōng)洗流通池，如有需要，可以用1n的硝酸。(不要用鹽酸)
④取出阻塞物或更換管子。參(cān)考檢測器手冊(cè)更換流通池窗。
⑤更改配比或流速。爲避免這個(gè)問題可定期檢查流動(dòng)相組成及流速。
⑥用中等強度的溶劑進行沖(chōng)洗，更改流動(dòng)相時，在分析前用10～20倍體積的新流動(dòng)相對柱子進行沖(chōng)洗。使用離子對試劑、緩沖(chōng)鹽更應注意平衡柱。
⑦檢查流動(dòng)相的組成。使用高品質的化學試劑及HPLC級(jí)的溶劑
⑧改變(biàn)分析條件。使用保護柱，如有必要，在進樣之間或在分析過程中，定期用強溶劑沖(chōng)洗柱子。
⑨重新設(shè)定基線。使用新的流動(dòng)相。
⑩将波長(zhǎng)調整至最大吸收波長(zhǎng)處。重選檢測(cè)波長(zhǎng)。
①在流動(dòng)相、檢測(cè)器或泵中有空氣(尖銳峰)。
④溫度影響(柱溫過(guò)高，檢測(cè)器未加熱)
⑤在同一條線上有其他電(diàn)子設備(bèi)(偶然噪聲)
①流動相脫氣。沖(chōng)洗系統以除去檢測(cè)器或泵中的空氣。
②檢查管路接頭是否松動(dòng)，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換(huàn)泵密封。
③用手搖動(dòng)使混合均勻或使用低粘度的溶劑(jì)
⑤斷開lc、檢測器和記錄儀，檢查幹擾是否來自於(yú)外部，加以更正。採(cǎi)用精密級穩壓電源。
原因
②流動(dòng)相污染、變(biàn)質或由低質溶劑配成
④檢測(cè)器/記錄儀電(diàn)子元件的問題
⑦流通池污染(即使是極少的污染物也會(huì)産(chǎn)生噪音。
⑩流動(dòng)相混合不均勻(yún)或混合器工作不正常
①檢查接頭是否松動(dòng)，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換(huàn)密封。檢查流通池是否漏液。
④斷開檢測(cè)器和記錄儀的電源，檢查並(bìng)更正。
⑥清洗檢測(cè)器，在檢測(cè)器後面安裝背景壓力調(diào)節器
⑩維修或更換(huàn)混合器，在流動(dòng)相不走梯度時，建議不使用泵的混合裝置
保留時間不重現有兩種不同的情況：既保留時間漂移和保留時間波動。前者是指保留時間僅沿單方向發生變(biàn)化，而後者指保留時間無固定規律的波動。将此兩種情況區分開來對找到問題的原因往往很有幫(bāng)助。如，保留時間的漂移往往由柱老化引起;而柱老化不可能引起保留時間的無規律波動。事實上，保留時間漂移的多半原因是不同機理的色譜柱老化，如固定相流失(例如，通過水解)，色譜柱污染(由樣品或流動相所緻)等。保留時間漂移的幾種最常見的原因如下：
如果我們觀察到保留時間漂移，首先應考慮色譜柱是否已用流動相完全平衡。通常平衡需要10～20個柱體積的流動相，但如果在流動相中加入少量添加劑(如，離子對試劑)則需要相當(dāng)長(zhǎng)的時間來平衡色譜柱。
流動相污染也可能是原因之一。溶於(yú)流動相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上，從(cóng)而造成保留時間的漂移。應注意：水是很容易污染的流動相成分。
固定相的穩定性都是有限的，即使在推薦的pH範圍内使用，固定相也會慢慢水解。例如，矽膠基質在pH=4時水解穩定性最好。水解速度與流動相類型和配體有關。雙官能團配體和三官能團配體比單(dān)官能團配體的鍵合相要穩定;長(zhǎng)鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩定;烷基鍵合相比氰基鍵合相穩定的多。
經常清洗色譜柱亦會加速色譜柱固定相的水解。其他矽(guī)膠基質鍵合相在水溶液環境中也可以發(fā)生水解，如，氨基鍵合相等。
保留時間漂移的另一個常見原因是色譜柱污染。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾並(bìng)吸附流動相攜帶(dài)的任何物質。污染源可以是：流動相本身，流動相容器，連接管、泵、進樣器和儀器密封墊，以及樣品等。通常通過實驗可判斷污染的來源。
樣品中如果存在色譜柱上保留很強的組分，就可能是使保留時間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質，如，配藥中的賦形劑，生化樣品(如，血清)中的蛋白及類脂類化合物，食品樣品中的澱(diàn)粉，環境水樣中的腐殖酸等。通常樣品中的強保留組分具有較高的分子量，在此情況下，保留時間漂移的同時或其後會有反壓的增加。可以通過使用固相提取(SPE)等樣品前處(chù)理方法來去除樣品基質的影響。
避免色譜柱污染最簡單的方法是防患於(yú)未然。相比之下，找到問題的所在並(bìng)設計有效的清洗步驟以去除污染物要困難的多。通常使用在給定色譜條件下的強溶劑，但並(bìng)非所有污染物都可以在流動相中溶解，如，thf可去除反相色譜柱中的許多污染物，但蛋白在thf中就不能溶解。dmso常常用於(yú)去除反相色譜柱中的蛋白。使用保護柱是個非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時採用的辦法。
流動(dòng)相組成的緩慢變(biàn)化也是保留時間漂移的常見原因。如流動(dòng)相中易揮發組分的揮發及循環使用流動(dòng)相等。
當小孔徑、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的水爲流動相時，有時會發生分離突然喪失及被分析物質保留明顯降低或完全不保留的現象，這就是疏水坍塌。此現象是由流動相不浸潤固定相表面而緻。挽救的辦(bàn)法實現用含大量有機組分的流動相浸潤固定相，再用高水含量的流動相進行平衡。色譜柱長(zhǎng)期儲存也會發生此現象。使用内嵌極性基團的反相色譜柱(如，waters symmetryshield rp色譜柱)或非端基封口的色譜柱(如，waters resolve色譜柱)也可避免發生坍塌。
①樣品體積過大--用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小於(yú)第一峰的15%;
②樣品溶劑過(guò)強--採(cǎi)用較弱的樣品溶劑;
③柱塌陷或形成短路通道--更換(huàn)色譜柱,採(cǎi)用較弱腐蝕性條件;
④柱内燒結不鏽鋼(gāng)失效--更換燒結不鏽鋼(gāng),加在線過(guò)濾器，過(guò)濾樣品;
⑤進樣器損壞(huài)--更換(huàn)進樣器轉子
①進樣閥(fá)殘(cán)餘峰--每次用後用強溶劑清洗閥(fá)，改進閥(fá)和樣品的清洗;
②樣(yàng)品中未知物--處(chù)理樣(yàng)品;
③柱未平衡--重新平衡柱,用流動(dòng)相作樣品溶劑(尤其是離子對(duì)色譜);
④三氟乙酸(tfa)氧化--每天新配，用抗氧化劑(jì);
⑤水污染(反相)--通過(guò)變(biàn)化平衡時間檢查水質量，用HPLC級的水;
①柱超載--降低樣品量,增加柱直徑採(cǎi)用較(jiào)高容量的固定相;
②峰幹擾--清潔樣品，調(diào)整流動(dòng)相;
③矽羟基作用--加三乙胺，用堿緻鈍化柱，增加緩沖(chōng)液或鹽的濃度降低流動相pH值，純(chún)化樣品;
④柱内燒結不鏽鋼(gāng)失效--更換燒結不鏽鋼(gāng)，加在線過(guò)濾器，過(guò)濾樣品;
⑤柱塌陷或形成短路通道--更換(huàn)色譜柱，採(cǎi)用較弱腐蝕性條件;
⑥死體積或柱外體積過大--連接點(diǎn)降至最低，對所有連接點(diǎn)作合适調整，盡可能採(cǎi)用細内徑的連接管;
⑦柱效下降--用較低腐蝕條件，更換柱，採(cǎi)用保護(hù)柱;
①樣品體積過大--用流動(dòng)相配樣，總的樣品體積小於(yú)第一峰的15%;
②在進樣閥(fá)中造成峰擴展--進樣前後(hòu)排出氣泡以降低擴散;
③數據系統採(cǎi)樣速率太慢--設定速率應是每峰大於(yú)10點;
④檢測(cè)器時間常數過(guò)大--設定時間常數爲感興趣第一峰半寬的10%;
⑤流動(dòng)相粘度過高--增加柱溫,採(cǎi)用低粘度流動(dòng)相;
⑥檢測(cè)池體積過(guò)大--用小體積池,卸下熱交換器;
⑦保留時間過(guò)長(zhǎng)--等度洗脫時增加強溶劑含量，也可用梯度洗脫;
⑧柱外體積過(guò)大--将連接管徑和連接管長(zhǎng)度降至最小;
⑨樣品過(guò)載--進小濃度小體積(jī)樣品。
19、除瞭(le)流速外，還有哪些因素能引起壓力改變(biàn)?改變(biàn)流動相組成和溫度;改變(biàn)柱長(zhǎng)、柱内徑和填料粒度;柱突然阻塞壓力升高(正常情況下其它條件不變(biàn)柱壓都是逐漸升高的)。
改變(biàn)流動相的組成或溶劑溶劑強度就可以改變(biàn)峰容量因子和保留時間。在一定條件下，減少保留時間或縮短分析時間的溶劑爲強溶劑，增加保留時間或延長(zhǎng)分析時間的溶劑爲弱溶劑。
在分析多組分樣品時，僅改變(biàn)流動(dòng)相的強度(組成百分比)而不改變(biàn)其組成，一般僅僅改變(biàn)所有組分的保留時間，不會發生峰位的重排。
下列條件改變(biàn)可能發(fā)生峰位重排：流動相中換瞭(le)強溶劑;pH值的改變(biàn);柱填料的改變(biàn);柱溫的改變(biàn);流動相的組成改變(biàn)(如，加入離子對試劑三乙基胺等)。
22、除瞭(le)在線脫氣，常用的實驗室脫氣方式還(hái)有哪些?加熱回流脫氣，脫氣效果最佳，但無法保持;氦脫氣，此方法脫氣效果佳，能除去百分之九十以上的空氣，但氦氣價格太貴，所以用的不多;真空脫氣，效果僅次於(yú)氦脫氣，但脫氣過程中容易造成樣品溶液揮發(fā)損失;超聲脫氣，隻能脫去約百分之三十的空氣，但，在實驗室中最常用。目前還是盡量争取用在線脫氣，方便且效果好。
23、評價(jià)一個(gè)色譜柱的最基本指标有那些?評介一根色譜柱的基本指标是：塔闆數、峰不對(duì)稱(chēng)因子、柱壓降、适用範圍和鍵合相濃度以及峰容量。
時間常數實際上是響應時間的設定，起著(zhe)過(guò)濾噪音的作用。時間常數太小(太快)可能增加短噪音，時間常數太大(太慢)可能出寬峰、拖尾峰。
25、爲什麽在實驗過(guò)程中有時會(huì)出現倒峰?所用的流動相在檢測(cè)波長下有吸收，而進在此波長下沒有吸收或吸收低於(yú)流動相的溶液，在流動相中會出現洞穴，通過柱後出現倒峰。
26、爲何會(huì)出現“胖”峰和平頭(tóu)峰?怎樣避免?用比流動(dòng)相強度大的大體積樣品進樣，通常會損害色譜圖的質量，而出現“胖”峰和平頭峰。應遵循下列規(guī)則選用溶劑溶解樣品：
a.最好用流動(dòng)相溶解樣品進(jìn)樣;
b.用大體積弱溶劑溶解樣品，如，反相色譜中用水溶解樣品進樣，主要缺點(diǎn)是每次進樣後在色譜圖的開頭出現大的負(fù)峰，有時還波及到樣品峰;
在良好的色譜分離中，樣品分子是以單(dān)一的保留過程被保留，如在反相色譜中，溶質與柱填料的非極性烷基鏈發生疏水性相互作用，但，在以矽膠爲基質的填料中，有些樣品組分能與矽醇基團相互作用，脫附的過程很慢，使峰嚴重拖尾，這就是次保留過程。對付次保留效應最有效的方法就是選用封尾更好色譜柱或加入流動(dòng)相改良劑(也叫掃尾劑)。
因柱溫問題很易引起前延峰，有些樣品在常溫下分離可見前延峰，提高溫度後前延峰的現象消失。在離子對色譜中，前延峰的另一個原因是用非流動相作樣品溶劑。因此在離子對色譜中要求僅用流動相溶解樣品，而且進樣量不要太大，否則會導緻前延峰或其它問題。在rp-HPLC中樣品溶液的強度大於(yú)流動相引起前延峰。增加流動相的強度，減少樣品溶液的強度，在離子對色譜中增加離子強度，可以克服前延峰的效應。此外使用流動相溶解樣品是解決的最簡單(dān)實用的方法。
a.在使用過(guò)程中柱本身退化，逐漸(jiàn)降低柱效;
b.柱外峰寬(kuān)效應。一根很好的專用柱用於(yú)另一液相色譜系統引起塔闆數降低，說明新系統有很大的柱外峰寬(kuān)效應;
c.化學效應，多數是流動(dòng)相和固定相相互作用所緻，改變(biàn)流動(dòng)相可使寬峰有所改善。
柱平衡慢的常見原因是，組分在舊的或新的流動(dòng)相中對(duì)柱吸附強，或者，在新的流動(dòng)相中濃度小甚至爲零：b.流動相含有離子對試劑;矽膠柱;流動相中有四氫呋喃。可考慮採(cǎi)用專用柱用於(yú)特殊的方法，不用時将柱折下來，注滿适當的溶劑或流動相，密封保管，不再作其它的分析。
a.内标物的結(jié)構(gòu)或理化性質應與被分析組分相似或相近;
b.内标物的保留值應稍大於(yú)或小於(yú)被分析物的保留，不能相差過(guò)大;
c.内标物的峰要與所有被分析物的峰有良好的分離度(r大於(yú)1.5)，不能讓内标物成瞭(le)幹擾物;
d.無結(jié)構(gòu)相似的内标物，可用保留相近的内标物;
e.儀器對(duì)分析物的響應與内标基本一緻，出峰面積(jī)大小不能相差懸殊。
32、管子切割與(yǔ)安裝注意事項(xiàng)?a.管子的斷(duàn)面必須垂直，否則，将會産(chǎn)生死體積而引起色譜峰峰形擴展。
b.確(què)保管子内表面不被損傷，如果損傷，可能會發(fā)生管路堵塞。
c.将管子完全插入開口端，直至其與開口端的末端相碰爲止。否則，将會(huì)産(chǎn)生死體積而引起色譜峰峰形擴展。
d.不要過(guò)分擰緊螺帽，以防損壞(huài)螺紋。
33、什麽(me)是HPLC的“無限直徑(jìng)效應”?在HPLC分析中由於(yú)使用瞭(le)高效微粒固定相及高壓流動相，樣品以柱塞式注入色譜柱後，因柱的阻力大，樣品分子在柱中的分子擴散很小，直至它從色譜柱流出也未與色譜柱内壁接觸，因而引起的色譜峰形擴展很小，能保持高柱效。
通常噪聲是指由儀器的電氣元件、溫度波動、電壓的線性脈沖(chōng)以及其他非溶質作用産(chǎn)生的高頻噪聲和基線的無規則波動;
漂移是基線的一種向上或向下的緩慢移動，可在較長(zhǎng)時間(0.5~1h)内觀察到。它可掩蔽噪聲和小峰。漂移與整個液相色譜系統有關，而不僅是由檢測(cè)器引起的;
在一個特定分離工作中， 檢測(cè)器是否有足夠的靈敏度是十分重要的。當比較檢測(cè)器時，常使用敏感度這一性能指标。敏感度即指信号與噪聲的比值(信噪比)等於(yú)2時，在單位時間内進入檢測(cè)器的溶質的濃度或質量。
在進行定量分析時，希望檢測(cè)器有寬的線性範圍，以便在一次分析中可同時對(duì)主要組分和痕量組分同時進行檢測(cè);
它應小於(yú)最早流出的死時間色譜峰的洗脫體積的1/10，否則會産(chǎn)生嚴重的柱外譜帶擴展。
設定泵使用一個單(dān)獨通路(a)，打開purge閥，流速5mL/min，提起其他溶劑瓶内的溶劑過濾頭直至離開液面，觀察這些通路(b、c、d)内的溶劑是否随著(zhe)流動，正常時均不應流動。
相關标簽：
掃描二維碼
分享
