我們建議在溶解之前用蒸餾水或無菌水進行小試,對於較短的寡肽(小於5aa)常常能夠直接溶解。對於其他的多肽,大多需要根據多肽的序列優化溶解條件,並測試幾種不同的溶劑,直至找到最優方法(超聲處理有助於打碎顆粒,增加溶解度)。
多肽的極性對(duì)溶解度有很大的影響:酸性的蛋白易溶解於(yú)堿性溶液,而酸性溶液則适合堿性蛋白。
可以用下表氨基酸的酸堿(jiǎn)度值的加和來計(jì)算多肽的酸堿(jiǎn)度:
氨基酸名稱 酸堿度賦值
氨基酸名稱 | 酸堿度賦值 |
D, E, C-terminus | -1 |
K, R, H, N-terminus | +1 |
F, I, L, M, V, W, Y, G, A, S, T, C, N, Q, P, 乙酰基,酰胺基 | 0 |
按上述原則,得分大於(yú)0爲堿(jiǎn)性多肽,得分小於(yú)0的爲酸性多肽,得分爲0爲中性多肽。
舉例說明:
RKDEFILGASRHD: (+5) + (-4) = +1 認(rèn)爲是堿(jiǎn)性多肽
EKDEFILGASEHR: (+4) + (-5) = -1 認(rèn)爲(wèi)是酸性多肽
AKDEFILGASEHR: (+4) + (-4) = 0 認(rèn)爲(wèi)是中性多肽
1. 對於(yú)堿性多肽,如果純水無法溶解,請嘗試10% - 30%的醋酸;如果多肽還是不溶,測(cè)試純醋酸和三氟乙酸TFA(<50 μl)來溶解,然後将多肽溶液稀釋到需要的濃度。
2. 對於(yú)酸性多肽,如果純水無法溶解,請嘗試13% 氨水(v/v)來溶解,並(bìng)稀釋至所需濃度。如果多肽序列中包含半胱氨酸Cys(C),不能用氨水溶解,需使用二甲基甲酰胺(DMF)或N-甲基吡咯烷酮 (NMP)進行溶解。對於(yú)容易聚集的多肽,則選擇6M的胍鹽酸(guanidine?HCl)或8M的尿素(Urea)來溶解,然後稀釋到需要的濃度。
3. 中性多肽應選用機溶劑來溶解。首先,嘗試使用乙腈 (acetonitrile) ,或甲醇 (methanol) 或異丙醇 (isopropanol)進行溶解;對於(yú)疏水性非常強的多肽,先用少量的二甲基亞砜(DMSO)溶解,並(bìng)用水稀釋到需要的濃度。同理,如果多肽序列中包含半胱氨酸Cys(C),需使用二甲基甲酰胺(DMF)或N-甲基吡咯烷酮 (NMP)進行溶解。對於(yú)容易聚集的多肽,則選擇6M的胍鹽酸(guanidine?HCl)或8M的尿素(Urea)來溶解,然後稀釋到需要的濃度。
問: 如何保存多肽?
答: 1. 爲瞭(le)方便儲(chǔ)存及後續使用,建議将多肽溶解至濃度爲1-2 mg/ml左右。
2. 爲瞭(le)防止或盡量減少多肽降解,請将多肽以凍幹粉形式保存在-20°C,-80°C更佳。如果需要保存溶液肽,最好分成小樣存放,以避免反複凍融。一份樣品融凍後未用完,應扔掉。細菌降解有時會成爲溶液肽的麻煩,所以請将肽溶於(yú)無菌水或肽溶液過濾除菌。
3. 多肽序列中含有甲硫氨酸Met(M),半胱氨酸Cys(C)或酪氨酸Tyr(Y),建議保存於(yú)無氧環(huán)境防止氧化。
問(wèn): 如何選擇适合自己研究的多肽純(chún)度?
答: 粗品肽不推薦用於(yú)生物實驗。粗肽可能含有大量的非肽類雜質,如殘(cán)留的有機溶劑、清除劑、TFA和其他不完整肽。TFA不能被完全消除,通常交付的肽以TFA鹽的形式存在。如果殘(cán)留的TFA影響您的實驗,我們推薦其他鹽形式,如醋酸鹽和鹽酸鹽等。這些鹽通常比常規TFA鹽貴20-30%以上。這是由於(yú)在轉化過程中出現更多的肽損失和需要更多的原材料。
NovoPro建議對各種項目採(cǎi)用以下級别的肽純(chún)度:
多肽純度 | 适用項目 |
>70% 肽純度 | 肽微陣列 |
>80% 肽純度 | 免疫印迹法(非定量) |
>90% 肽純度 | NMR研究 |
>95% 肽純度 | ELISA試驗和RIA(定量) |
>98% 肽純度 | NMR研究 |